Bu yazı, viral entegrasyon bölgelerini tanımlayarak bu bölgelerin tespitinin gen terapisi çalışmalarındaki önemini ele alıyor. Ayrıca bu analizler için kullanılabilecek biyoinformatik analiz araçları hakkında bilgi sunuyor.
Yazan: Mehmet Umur Aslan
Entegrasyon bölgeleri nedir?
Entegrasyon bölgeleri, viral vektörlerin konak hücrenin DNA’sına çeşitli mekanizmalarla yerleştiği spesifik bölgelerdir. Kullanılan vektör türleri genellikle; adeno-ilişkili, lentiviral ve diğer retroviral vektörler olmakla birlikte entegrasyon sonucundaki konak hücrelere transdükte hücreler denir. Transdüksiyon işlemi için genellikle lentiviral ve adeno-ilişkili vektörlerin seçilmesinin temel sebebi, bu vektörlerin hem bölünebilen hem de bölünemeyen geniş çapta hücre türlerini yüksek verimlilikle transdükte edebilmeleridir. Bu özellikleri nedeniyle her iki vektör tipi de klinik gen terapisi uygulamaları için ideal araçlar haline gelmiştir.
Viral vektörler nasıl çalışır?
Retroviral ve adeno-ilişkili vektörler farklı mekanizmalarla konak genomuna entegre olurlar. Retroviral vektörlerde iki protein başrolü paylaşmaktadır. Bunlar, ters transkriptaz ve integraz enzimleridir. RNA halinde konak hücrenin nükleusuna giren viral vektör genetik materyalini ters transkriptaz ile DNA’ya çevirir ve bu DNA integraz enzimi sayesinde konak genomuna eklenir.1 Adeno-ilişkili vektörler ise nükleusta episomal DNA adı verilen bağımsız genetik materyaller oluşturur ve doğrudan genomun içine girmez.2
Bu vektörleri konak hücrelere neden gönderiyoruz?
Araştırma çalışmalarında bunun birçok sebebi olabilir. Başlıca sebepler arasında eksik gen ekleme, terapötik protein üretimi, onkolitik tedavi ve gen düzenleme araçlarının taşınması olarak sayılabilir. Hedefler ve çalışma tasarımları farklı olsa da temel amaç, gönderdiğimiz bu vektörler ile hedef hücrede istediğimizi değişimleri sağlamaktır.
Entegrasyon bölgelerini bulmak neden önemli?
Viral vektörler hedef hücrelere ulaştıktan sonra hikaye daha yeni başlar. Viral vektörün nerede bir entegrasyon bölgesi oluşturacağı oldukça kritiktir. Bu nedenle de entegrasyon bölgelerinin genom üzerinde nerede olduğunu bulmamız büyük önem taşır. Başlıca nedenler arasında; genotoksisite analizi, viral enfeksiyon araştırmaları, kişiselleştirilmiş tıp, terapötik gen ekspresyonu ayabiliriz.
- Genotoksisite analizi: Viral vektörlerin hem yerleştikleri entegrasyon bölgelerindeki hem de yakındaki genlerin aktivitesinde değişikliğe neden olabileceğini biliyoruz. Tahmin edersiniz ki bir gen terapi çalışmasında entegrasyon bölgesinin yakındaki onkogeni aktive etme veya tümör baskılayıcı geni inaktive etme ihtimali istemediğimiz sonuçlardır. Bu nedenle genotoksisite risk analizi yapılabilir.
- Viral enfeksiyon araştırmaları: Entegrasyon bölgelerinin dağılımı referans alınarak virüslerin konak üzerindeki potansiyel yayılımı analiz edilebilir. Böylece yeni terapötik moleküller araştırılabilir.
- Kişiselleştirilmiş tıp: Aynı tip vektör çeşitlerinde dahi her hastada entegrasyon bölgelerinin yayılma paterni farklı olduğundan kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için önemli bilgiler sağlayabilir.
- Terapötik gen ekspresyonu: Entegrasyon bölgeleri gen ekspresyonunu etkiler ama nasıl etkileyeceği kesin değildir. Bu nedenle entegrasyon bölgelerinin analizleri, hangi bölgelerin optimum gen ekspresyonu sağladığını, hangi hücre tiplerinde daha güçlü terapötik etki edilebileceği değerlendirilebilir.
Biyoinformatik araçlarla entegrasyon bölgelerinin analizi
Şimdiye kadar entegrasyon bölgelerine neden ihtiyacımız olduğunu anlattık ancak bunu nasıl yapacağımızdan bahsetmedik. Entegrasyon bölgelerinin bulunabilmesi için birçok biyoinformatik araç geliştirilmiştir. VISPA2,3 ISLING4 ve INSPIIRED5 bu analizlerde sıklıkla kullanılan araçlar olarak sayılabilir. Çalışma prensiplerindeki detaylarda farklılık gösterseler de bu araçların iş akışı benzerdir ve aşağıdaki dört adımda özetlenebilir:
1. Kalite kontrolü ve filtreleme
Bu dört temel adımın birincisi olan kalite kontrolü için genellikle FASTQC kullanılır. FASTQC, sekansların “Phred Skor” değerlerini referans alarak “fastq” dosyalarının kalite kontrol dosyalarını oluşturur. Ardından filtreleme aşaması da bu kalite kontrol dosyası değerlendirilerek yapılır. İstenmeyen kalite skorundaki sekanslar ve yeni nesil dizileme öncesi kütüphane hazırlığı aşamasında eklenen ancak analiz sırasında istenmeyen sekanslar filtrelenir. Bu aşamada genellikle Trimmomatic veya SeqPrep kullanılır.
2. Hizalama
Filtreleme sonrası elimizde kalan sekanslarımız ile kimi zaman konak referans genomuna kimi zaman da viral referans genomuna hizalama yapılır. Bu durum kullanılan biyoinformatik aracın iş akışına göre değişmektedir. Hizalama aşamasında genellikle BWA-MEM kullanılır ancak farklı hizalama araçlarının kullanılması da gayet olağandır. Örneğin INSPIIRED, BLAT kullanmaktadır.3 Ayrıca değinilmesi gereken bir nokta ise hizalama parametrelerinin önemidir. Doğru parametrelerle hizalamadığımızda gerçek entegrasyon bölgeleri doğru bir şekilde tespit edemeyebiliriz.
3. Hizalamaları filtreleme
Sonrasında yaptığımız hizalamaların istediğimiz gibi olup olmadığını kontrol ederiz. Bunu da bir eşik değeri belirleyerek yaparız. Örnek verecek olursak VISPA2’de bu filtreleme δ skoru belirlenerek yapılırken3 ISLING’te “Global Identity Score” baz alınarak yapılmaktadır.4
4. Kümeleme ve annotasyon
Dört temel adımımızın sonuncusu olarak kümeleme işleminde ise genellikle lokasyonu net bir şekilde belli olan entegrasyon bölgeleri ve belli olmayan entegrasyon bölgeleri ayrı ayrı kümelenir. Belirlenen entegrasyon bölgeleri ve yakındaki genom bölgelerinin annotasyonu yapılarak muhtemel etkilerin analizi yapılır.
Sonuç
Genom entegrasyon bölgelerinin analizi çeşitli moleküler biyoloji çalışmalarında ihtiyaç duyulan önemli bir analizdir. Genotoksisite analizinden kişiselleştirilmiş tıbba, viral enfeksiyon araştırmalarından terapötik gen ekspresyon optimizasyonuna kadar geniş bir yelpazedeki uygulamalar, bu moleküler haritalamanın ne denli çok yönlü olduğunu göstermektedir. Bu analizler için kullanılan mevcut biyoinformatik araçların iyileştirilmesi ve yeni araçların geliştirilmesi ile daha hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek mümkün olacaktır. Böylece gen terapisi uygulamalarının potansiyel risklerinin minimize edilmesi yoluyla daha güvenli, kişiselleştirilmiş gen tedavilerinin geliştirilmesine katkı sağlanabilir.
Kaynaklar
1 Milone, M.C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia 32, 1529–1541 (2018). https://doi.org/10.1038/s41375-018-0106-0
2 Deyle DR, Russell DW. Adeno-associated virus vector integration. Curr Opin Mol Ther. 2009 Aug;11(4):442-7. PMID: 19649989; PMCID: PMC2929125.
3 Spinozzi, G., Calabria, A., Brasca, S. et al. VISPA2: a scalable pipeline for high-throughput identification and annotation of vector integration sites. BMC Bioinformatics 18, 520 (2017). https://doi.org/10.1186/s12859-017-1937-9
4 Suzanne Scott, Claus V. Hallwirth, Felix Hartkopf, Susanna Grigson, Yatish Jain, Ian E. Alexander, Denis C. Bauer, Laurence O.W. Wilson, Isling: A Tool for Detecting Integration of Wild-Type Viruses and Clinical Vectors, Journal of Molecular Biology, Volume 434, Issue 11, 2022, 167408, ISSN 0022-2836, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2021.167408
5 Eric Sherman, Christopher Nobles, Charles C. Berry, Emmanuelle Six, Yinghua Wu, Anatoly Dryga, Nirav Malani, Frances Male, Shantan Reddy, Aubrey Bailey, Kyle Bittinger, John K. Everett, Laure Caccavelli, Mary J. Drake, Paul Bates, Salima Hacein-Bey-Abina, Marina Cavazzana, Frederic D. Bushman, INSPIIRED: A Pipeline for Quantitative Analysis of Sites of New DNA Integration in Cellular Genomes, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, Volume 4, 2017, Pages 39-49, ISSN 2329-0501, https://doi.org/10.1016/j.omtm.2016.11.002
