Düşük Biyokütleli Mikrobiyomları Çalışma Rehberi

Yazan: Hüma Sultan Kalkan & Sıla Savga

Buzdağının görünen yüzünde çok sayıda mikroorganizma yaşıyor. Peki ya buzdağının görünmeyen yüzünde? Uzun bir süre boyunca hiçbir canlı yaşamıyor sandığımız yerler bilim insanlarının merakı ve günümüz teknolojileri ile gün yüzüne çıkarılmaya çalışılıyor. Fakat bu çalışmaları yürütmek sanıldığı kadar kolay değil. 

DNA miktarı yok denecek kadar az olduğunda standart yöntemler yeterli olmayabilir ve kontaminasyon riski ciddi bir tehdit haline gelir. Öyle ki düşük mikrobiyom kütleli alanlarda yapılmış birçok çalışmada elde edilen mikrobiyal çeşitliliğin kontaminasyon kaynaklı olduğu tespit edilmiştir. 

Günümüz yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri kültüre alınamayan mikrobiyal toplulukları tespit edebilmesi ve çok düşük miktardaki örneklerden bile detaylı analiz yapma kapasitesine sahip olmasıyla araştırmacılara önemli fırsatlar sunuyor. Ancak bu yüksek hassasiyet, aynı zamanda en ufak kontaminasyonun bile sonuçları ciddi şekilde çarpıtmasına neden olabilir.

Bu yazımızda düşük mikrobiyom kütleli ortamların ne olduğunu, karşılaşılan zorlukları ve kontaminasyonu önlemek için uygulanabilecek stratejileri detaylı bir şekilde inceleyeceğiz. 

Nedir bu düşük biyokütleli mikrobiyomlar?

Düşük mikrobiyom kütleli ortamlar neredeyse hiç mikrobiyal DNA içermiyor gibi görünebilir. Dolayısıyla az miktardaki DNA’ya ulaşmak için örneklerin toplanma aşamasından dizi verisinin üretildiği ana kadar maksimum titizlikle çalışılmalıdır. Bu tür ortamlardan bazıları şunlardır:

Kontaminasyon: En büyük tehdit

Kontaminasyon, toplanan örneklere dışarıdan gelen istenmeyen mikrobiyal DNA olarak tanımlanabilir. Yüksek mikrobiyom kütleli örneklerde (örneğin; yüzey toprağı, atık su, insan dışkısı) hedeflenen DNA miktarı fazla olduğu için kontaminasyon daha az sorun teşkil eder. Ancak düşük mikrobiyom kütleli sistemlerde, en ufak DNA kirleticisi bile çalışma sonuçlarını ve yorumlarını yanlış yönlendirebilir. 

Kontaminasyonun pek çok kaynağı bulunur. Bu kaynaklar şunlardır: ¹

• İnsan operatörler
• Örnekleme ekipmanları
• Bitişik ortamlar
• Reaktifler/Kitler
• Laboratuvar ortamları
• Diğer örnekler/kültürler

Kontaminasyon türleri

Mikrobiyom çalışmalarında iki kontaminasyon çeşidi öne çıkmaktadır:

Kontaminant DNA: Çalışılan örnekler dışındaki kaynaklardan gelen DNA’dır. Örnek toplama ve hazırlık sırasında ne kadar titiz olunursa olunsun kontaminant DNA birçok yerden kaynaklanabilir. Bu kaynaklardan bazıları şunlardır:

• Hava, yüzeyler, ekipmanlar,
• Araştırmacı üzerinden gelen mikrobiyal DNA’lar
• Tüpler ve pipetler
• Nükleik asit izolasyon kitleri ve laboratuvar reaktifleri  
• Önceki çalışmalar veya dizileme analizlerinden kalan kalıntılar

Çapraz Kontaminasyon: Bir çalışmada örnekler arasındaki DNA alışverişidir. Örnek işleme sürecinin birden fazla adımında meydana gelebilir. 

• İlk örneklerin işlenmesi sürecinde örnekteki DNA'nın yanlışlıkla diğer tüpler veya plakalara aktarılması. 
• Pipetleme sırasında veya plaka kapağı çıkarılırken meydana gelen aerosolizasyon.
• Barkod çapraz kontaminasyonu ("tag switching" veya "index hopping") olarak bilinen yanlış barkodların özellikle bazı dizileme platformlarında komşu kuyucuklara veya tüplere atlaması.
• Dizileme esnasında barkod dizileme hataları veya önceki dizileme çalışmalarından kalan artık amplikonlar

Kontaminasyon ve çapraz kontaminasyon mikrobiyom çalışmalarının üç basamağında ortaya çıkabilir [Fierer vd. ² makalesinden uyarlanmıştır.]

Kontaminasyonun araştırmalara etkileri

Kontaminant DNA ve çapraz kontaminasyonun miktarı ve bileşimi, zamanla ve konuma göre değişerek düşük biyokütleli mikrobiyom örneklerinde biyolojik olarak algılanabilen yanlış pozitif sinyaller oluşturur. Kontaminasyon kaynaklı bu sinyaller çalışmaların sonuçlarını çarpıtabilir. 

Örneğin, son yıllarda yapılan bazı çalışmalarda insan plasentasında ayrı bir mikrobiyal topluluğun var olduğu iddia edilmiş fakat yapılan deneyler sonucunda plasentanın kalıcı bir mikrobiyoma sahip olmadığı, tespit edilen bakteri topluluklarının kontaminasyon kaynaklı olduğu anlaşılmıştır. Bu çalışma ile birlikte plasentanın nadiren de olsa patojenik durumlar haricinde steril olduğu kabul edilmiştir. ²

Benzer şekilde beyin dokusu, meme dokusu, seminal sıvı gibi diğer örneklerde de yaygın kontaminant taksonlar, gözlemlenen biyolojik sinyalleri etkilemiştir.

Kontaminasyonun varlığı mikrobiyom araştırmalarının güvenilirliğini ciddi şekilde etkileyebildiğinden azaltılması ve engellenmesi oldukça önemlidir.

Kontaminasyonun azaltılması ve engellenmesi

Düşük mikrobiyom kütleli ortamlarda çalışırken kontaminant DNA ve çapraz kontaminasyonu kontrol altına almak için üç ana strateji benimsenebilir:

a. Tüm kontaminasyon türleri ve karıştırıcı faktör etkileri sınırlanmalıdır.

• Rastgele örnekleme yapılmalı.
• Koruyucu giysi ve ekipmanlar kullanılmalı.
• Örnekler izole, düşük kontaminasyonlu, kontrollü bir ortamda (örneğin, laminer akışlı kabin) işlenmelidir. 
• Yüzeyler, laboratuvar ekipmanları ve reaktifler mümkün olan en düşük kontaminasyon seviyesine sahip olmalıdır. "DNA içermez" etiketli sarf malzemeleri bile degrade olmuş mikrobiyal DNA içerebilir. [1.3] Bu sebeple yüzeyler sodyum hipoklorit (%3) ve UV radyasyonu ile sert yüzeyli sarf malzemeleri etilen oksit ile reaktifler ise UV ile dezenfekte edilmelidir.
• Çapraz Kontaminasyonu azaltmak için kitaplık hazırlığı ve DNA ekstraksiyonu farklı odalarda yapılmalıdır. (ön-PCR ve sonrası-PCR çalışmaların fiziksel olarak ayrılması). 
• Filtreli pipet uçları ve düşük aerosol pipetleri kullanılmalıdır. 
• Dizileme sırasında indeks takasını önlemek için benzersiz, yedekli çift indeksleme yapılmalıdır.
• Dizileme cihazında düzenli sodyum hipoklorit ve bakım yıkamaları yapılmalıdır. 
• Yüksek ve düşük biyokütleli örnekler birlikte işlenmemelidir.

b) Kontroller mutlaka çalışmaya dahil edilmelidir.

Her analizde kontaminant DNA'yı izlemek ve çapraz kontaminasyon seviyelerini değerlendirmek için çeşitli kontrol türleri kullanılır. Bu kontroller şunlardır:

Negatif Kontroller: Kontaminantların ne zaman ve nasıl tanıtıldığını tespit etmeye yardımcı olur. Her örnekleme, ekstraksiyon veya amplifikasyon partisi için en az bir adet dahil edilmelidir. Büyük çalışmalar için (robotik sistemler kullanan 96 kuyucuklu plakalar) her bir çalışma en az sekiz adet negatif kontrol önerilmektedir.

• Örnekleme Kontrolleri (Sampling Blank Controls): Örnekleme prosedürü sırasında (swaplar, gazlı bezler, matkaplar, koruyucular) tanıtılan kontaminant DNA'yı tespit eder.
• DNA Ekstraksiyon Kontrolleri (DNA Extraction Blank Controls): Ekstraksiyon kitleri, moleküler reaktifler ve laboratuvar ortamından gelen kontaminant DNA içeriğini izler.
• Amplifikasyon Kontrolleri (No-Template Amplification Controls): Kitaplık hazırlığı ve dizileme sırasında reaktiflerde ve laboratuvar ortamında bulunan kontaminant DNA'yı izler.

Pozitif Kontroller: Tespit limitini belirlemek ve çapraz kontaminasyonun etkilerine dair bilgi sağlamak için kullanılır.

• DNA Ekstraksiyon Pozitif Kontrolleri (DNA Extraction Positive Controls): DNA ekstraksiyon verimliliğini izler, algılama limitini belirler ve ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyon seviyelerini inceler. Bilinen hücre tiplerinin seri seyreltmeleri (örneğin, Zymo mock community) örneklerle birlikte çıkarılmalıdır.
• Amplifikasyon Pozitif Kontrolleri (Positive Amplification Controls): Kitaplık hazırlığı aşamasında işlenen bilinen organizma türlerinden DNA titrasyonunu içerir.

Kontrol örnekleri, biyolojik örneklerden daha düşük miktar ve kalitede kütüphaneler üretse bile dizilenmelidir.

c) Veri analizi sırasında kontaminasyon etkileri değerlendirilmeli ve raporlanmalıdır.

• Kontaminasyon seviyesini belirleyin: Kontrol örneklerini biyolojik örneklerle karşılaştırarak kontaminasyon seviyesini ve türlerini değerlendirin. Kantitatif PCR (qPCR) kullanılabilir.
• Kontaminant taksonları raporlayın: Negatif kontrollerde tespit edilen taksonlar açıkça raporlanmalıdır. Çalışmanızda önemli sonuçları yönlendiren yaygın kontaminant taksonlar listesi (Tablo 1'de belirtilenler) için ekstra şüphecilikle yaklaşılmalı ve bulguların kontaminasyondan kaynaklanmadığına dair kanıt sunulmalıdır.
• Çıkarıcı filtreleme (Subtractive Filtering): Negatif kontrollerde tespit edilen kontaminant taksonlar biyolojik örneklerden çıkarılabilir. Ancak bu biyolojik sinyal kaybına yol açabileceği için daha incelikli yaklaşımlar önerilir.
• Biyoinformatik modelleme: SourceTracker gibi araçlar, biyolojik örneklerdeki potansiyel kontaminant taksonların oranını ve kaynağını tahmin etmek için Bayesçi modelleme kullanabilir.
• RIDE kontrol listesi: Düşük biyokütleli mikrobiyom çalışmaları için asgari standartlar şunlardır:
• Raporla (Report): Deney tasarımını ve kontaminasyonun katkılarını azaltmak ve değerlendirmek için kullanılan yaklaşımları raporlayın.
• İlave Et (Include): Kontaminant DNA'yı değerlendirmek için kontrolleri dahil edin.
• Değerlendir (Determine): Biyolojik örnekleri kontrollerle karşılaştırarak kontaminasyon seviyesini belirleyin.
• Ele Al (Explore): Her çalışmada kontaminant taksonları inceleyin ve biyolojik örneklerin yorumlanması üzerindeki etkilerini raporlayın. 
• Şeffaflık: Analiz sırasında kontaminant DNA'nın etkilerini tanımlamak ve en aza indirmek için kullanılan yaklaşım, tekrarlanabilirliği artırmak için açıkça raporlanmalıdır.

Kontaminant DNA’nın etkilerinin azaltılması için uygulanabilecek metotlar [Fierer vd. ² makalesinden uyarlanmıştır.]

Sonuç

DNA tabanlı yaklaşımlarla mikrobiyomları analiz ederken, özellikle düşük biyokütleli sistemlerde kontaminasyonun ve çapraz kontaminasyonun kaçınılmaz olduğunu varsaymak en doğrusudur. Araştırmalar sırasında potansiyel kontaminasyonu kontrol etmeyi ve en aza indirmek için uygun kontrolleri kullanmayı hedeflemek gerekir.

Kontaminasyonu minimize etmek için kullanılan prosedürleri, tespit edilen kontaminantları ve potansiyel kontaminantların sonraki analizlerde nasıl ele alındığını raporlanmalıdır. Raporlama yapmak şeffaflığı artırdığından elde edilen bulgulara daha fazla güvenilmesini sağlar.

Kontaminasyonun farkında olup çalışmaları bu bilinçle yönlendirmek mikrobiyom çalışmalarının genel kalitesini arttırıp geçmişte yayınlanan çalışmalardaki belirsizliklerin giderilmesine yardımcı olur.

Teknolojinin gelişimi durmaksızın ilerlerken bilimsel gelişmeler de aynı hızda bu gelişime eşlik ediyor. Geliştirilecek yeni yöntemler ve prensipler ile bilimde doğru kabul ettiğimiz birçok bilginin değişmesi de çok muhtemel. Kesin olan bir şey varsa o da bilimin her adımda daha doğru verilere ulaşacak olmasıdır. 

Kaynaklar

¹ Eisenhofer, Robert, et al. “Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations.” Trends in Microbiology, vol. 27, no. 2, 2019, pp. 105–117. Trends in Microbiology, https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.11.003.

² Fierer, Noah et al. “Guidelines for preventing and reporting contamination in low-biomass microbiome studies.” Nature microbiology vol. 10,7 (2025): 1570-1580. doi:10.1038/s41564-025-02035-2

³ de Goffau, M. C., et al. “Human placenta has no microbiome but can contain potential pathogens.” Nature, vol. 572, no. 7769, 2019, pp. 329–334. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1451-5.